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“Usted puede ir a mercar en un Ferrari, pero lo puede hacer también en bicicleta, en un cachivache”, es el primer intento del profesor Gustavo Gámez, de la Universidad de Antioquia, para explicar en qué consisten las pruebas LAMP, una posible solución al atolladero de pruebas en el que se encuentra Colombia. Gámez habla con entusiasmo del asunto, pero también arrastra en la voz algo de frustración ante los obstáculos y barreras para hacerse escuchar.
Desde que comenzó la pandemia, junto a sus colegas de la universidad entendieron que la realización de pruebas sería un cuello de botella, así que se volcaron al estudio del virus SARS-CoV-2 y su identificación. Pensar en controlar la curva de la epidemia sin suficientes pruebas es perder de entrada la carrera contra el virus. El director de la OMS con su casi impronunciable nombre, Tedros Adhanom Ghebreyesus, lo advirtió hace mucho: “Pruebas, pruebas, pruebas”. Si uno no sabe dónde está su enemigo no lo puede combatir. Así de sencillo.
Colombia, al comienzo de la pandemia, apenas llegaba a las 2.000 pruebas diarias, conocidas como PCR en tiempo real. El virus comenzó desnudando nuestra pobre inversión en ciencia y tecnología. Afortunadamente un esfuerzo conjunto de universidades, centros de investigación privados y el Instituto Nacional de Salud permitió que hoy 93 laboratorios en varias partes del país realicen en total 30.000 pruebas diarias. Un logro, sin duda, pero insuficiente.
“El país y el INS, como rector de la red de laborarorios, han hecho un esfuerzo enorme para incrementar la capacidad de testeo a 30.000 pruebas/día. Ese es un gran logro. Sin embargo, el nivel de testeo actual, a pesar de que es mucho es insuficiente para reducir por sí mismo la transmisión de una forma sostenida que logre reemplazar el distanciamiento social. La razón es sencilla, entre más casos y más contactos (por reaperturas) más pruebas se necesitan ahora y en el futuro cercano. Para que el testeo tenga un impacto sustancial en el número reproductivo efectivo se requieren dos cosas: 1) muchas más pruebas y 2) que el resultado esté antes de 48 horas”, advirtió la epidemióloga Zulma Cucunubá, investigadora del Imperial College de Londres, durante una de las presentaciones de la nueva estrategia para hacer frente a la pandemia, que obviamente fue bautizada con una de esas siglas tan populares en el sector público: estrategia PRASS (Pruebas, Rastreo y Aislamiento Selectivo Sostenible), que hizo Andrés Villamizar, coordinador de la Gerencia para la Atención Integral de la Pandemia COVID-19.
¿Cuántas pruebas necesitamos al día? Es un número difícil de estimar, que además cambia dependiendo de la velocidad a la que vaya el virus. Pero hoy esa cifra podría estar por encima de las 100.000 pruebas diarias. El costo de los aparatos (termocicladores) necesarios para hacer pruebas PCR en tiempo real, las instalaciones que exigen y la capacitación de personas para llevarlas a cabo hace casi imposible pensar que Colombia pueda superar en el corto plazo la barrera de las 30.000 diarias. Sobre todo porque la alternativa, las pruebas rápidas diseñadas para detectar no el virus sino los anticuerpos que genera el sistema inmune del paciente, tampoco ha resultado muy útilhasta ahora.
Un rápido viaje al año 2000 en Japón
El 15 de junio de 2000, el japonés Tsugunori Notomi y seis colegas firmaron un artículo en la revista Nucleic Acid Research en el que cantaban victoria: “Hemos desarrollado un método novedoso, denominado amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), que amplifica el ADN con alta especificidad, eficiencia y rapidez en condiciones isotérmicas”.
Notomi trabajaba en la Escuela de Medicina de la U. de Tokio, pero también tenía un pie en la empresa Eiken Chemical, creada en 1939, especializada en dispositivos y pruebas médicas. Un problema que ya se había hecho evidente despuntando el nuevo milenio era que las tradicionales pruebas de amplificación de ADN como la PCR, útiles en muchos campos de la ciencia, desde la agricultura hasta la medicina, exigían costosos equipos.
“A pesar de la simplicidad y la magnitud de amplificación que se puede obtener, el requisito de un termociclador de alta precisión en PCR evita que este poderoso método sea ampliamente utilizado como una herramienta de diagnóstico de rutina”, razonaba Notomi. Un termociclador para la PCR en tiempo real es un aparato que controla rápidos cambios de temperatura necesarios en el proceso de amplificar el ADN, que cuesta entre $100 y $200 millones (uno estándar vale de $30 a $50 millones). La principal ventaja del método que proponía Notomi lo insinuaba en la palabra “isotérmico”; es decir, todo a la misma temperatura.
Fotocopiadoras de ADN
El biólogo molecular Pablo Ortiz compara las pruebas de amplificación de ADN en general (PCR, qPCR y LAMP) con una fotocopiadora. Si un virus es una minúscula e imperceptible partícula, lo es más aún el pedacito del material genético que lleva en sus entrañas. Por eso es necesario copiar y copiar y copiar un fragmento de ese material genético hasta alcanzar tal cantidad que sea posible identificarlo con un truco extra del proceso: que brille gracias a la adición de sustancia fluorescente que se adhiere a ellos, un fluoróforo.
El primer paso para el proceso de fotocopiado es abrir la cadena de ADN que está conformada por dos hebras. En el caso de los virus que tienen ARN es necesario primero convertir el ARN a ADN. Para abrir esa cadena se eleva la temperatura a 95° Celsius. Luego es necesario bajar la temperatura a 60° Celsius para que los primers, una especie de molde fabricado previamente, se acoplen al fragmento de ADN específico que se quiere replicar.
Una vez ocurre esto se vuelve a elevar la temperatura, esta vez a unos 72° Celsius para que la fotocopiadora propiamente dicha, una enzima conocida como polimerasa, copie los fragmentos iniciados por los primers. El proceso se debe repetir varias veces para tener el número suficiente de copias. Si el material genético del virus estaba presente en la muestra entonces brillará lo suficiente al unirse a los fluoróforos, los fragmentos luminiscentes que se añaden.
La prueba LAMP, explica Ortiz, también considerada una técnica de amplificación de ADN, prescinde del termociclador. Y tampoco utiliza una cámara de alta resolución para detectar la fluorescencia, pues basta con saber si hay o no un cambio en el color de la muestra. Esas características la convierten en la técnica ideal para lugares de difícil acceso y pocos recursos.
“Todo lo que necesitas es una conexión eléctrica estable y un baño seco de temperatura uniforme”, explica Ortiz. En el mercado el dispositivo para generar esos baños secos los venden por $2 o $3 millones. “Si se tienen los recursos suficientes es mejor hacer PCR en tiempo real, porque es una prueba de alta sensibilidad. Con LAMP las probabilidades de contaminación cruzada son más altas, y si la persona no tiene experiencia se le pueden contaminar las muestras, resultando en falsos positivos. Pero si esa barrera humana no existe la técnica puede ser extremadamente útil para un testeo masivo”.
LAMP a ritmo de tango
En 2011 la investigadora argentina Carolina Carrillo, del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (Conicet), comenzó a interesarse por la técnica de LAMP. Primero la vio como una alternativa para ayudar en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas en bebés recién nacidos. Con fondos del gobierno y en una alianza público privada, desarrolló junto a sus colegas la primera prueba LAMP para chagas.
Al adueñarse de los secretos de la técnica, cada vez les resultó más fácil usarla para diferentes objetivos. Así que además de chagas aprendieron a usarla para diagnóstico de sífilis y brucelosis, y su colega Adrián Vojnov se aventuró a las infecciones en cultivos de cítricos y a la adaptación para el diagnóstico de dengue. Antes de que el coronavirus SARS-CoV-2 se asomara en el continente, ya Santiago Werbajh, otro miembro del equipo, estaba enfilando su experiencia hacia este nuevo virus.
“Cuando llegó la COVID-19 a nuestras vidas pudimos responder con cierta rapidez. Ya habíamos transitado ese camino de fallar e intentar una vez tras otra”, relata Carrillo desde Argentina. El dengue, al igual que el coronavirus, es un virus de ARN, así que conocían bastante bien los tropiezos que podían tener al adaptar una prueba LAMP. Fue una carrera contra el tiempo. Primero usar bioinformática para definir los primers, los moldes. Luego encargarlos a Corea y esperar llenos de ansiedad casi un mes para que llegaran. Después hacer y hacer pruebas hasta cerciorarse de que todo funcionaba como querían.
“La prueba de LAMP es una prueba fácil de hacer cuando está desarrollada, pero tiene muchos trucos para su desarrollo, que son como los de las recetas de cocina. Creo que la mayor complejidad está en desarrollar los primers, los anzuelitos moleculares”, cuenta Carrillo.
El esfuerzo valió la pena. En alianza con la empresa NEOKIT crearon el NEOKIT-Covid-19 kit necesario para hacer la prueba LAMP y demostraron que, en comparación con la tradicional PCR, sus resultados eran sólidos. Estos kits incluyen las enzimas básicas para que cualquier persona entrenada realice la prueba en su laboratorio. Hoy están produciendo 10.000 pruebas diarias, que en manos del Estado argentino están siendo enviadas a distintos lugares de la provincia de Buenos Aires para aumentar la capacidad de testeo. El valor ronda los $8 dólares por prueba.
Uruguay, en la misma ruta
Un poco más atrás en el camino van los investigadores uruguayos Laura Romanelli y Gustavo Salinas. Ambos venían explorando el potencial de las prueba LAMP en otras enfermedades y cuando se desató la pandemia por SARS-CoV-2 también entendieron que valía la pena apostar por las pruebas LAMP.
“La técnica LAMP no es que sustituya la PCR, porque no puede llegar a la misma sensibilidad”, dice Gustavo en una videollamada, “pero llega a alta sensibilidad y se puede discriminar la mayor parte de los infectados”.
Un grupo pequeño como el de ellos, apenas cinco personas y el apoyo del Instituto Pasteur de Montevideo junto a la U. de la República, les ha permitido avanzar con una prueba que funciona en el laboratorio. A diferencia de los argentinos, no han dado el paso de conectarse con la empresa privada para escalar y producirlos de forma masiva. Por el tamaño de su población y la capacidad actual de PCR, Uruguay no tiene una brecha tan grande en capacidad de pruebas.
“Es una técnica que no tiene la historia de PCR y recién se está probando a escala masiva”, comenta Romanelli al advertir que los riesgos de contaminación y errores son mayores, pero se pueden controlar.
Varios intentos colombianos
Además del grupo de la U. de Antioquia, otros también están intentando crear pruebas LAMP para coronavirusen el país. Uno de ellos es el que lidera Beatriz Parra en la U. del Valle con su colega María Aurora Londoño. En los últimos años habían comenzado a trabajar en la técnica LAMP pero aplicada a pruebas de zika y dengue. Rápidamente entendieron que esa experiencia y conocimiento se podían aplicar a una prueba para coronavirus.
“LAMP es una prueba rápida que puede funcionar en un laboratorio sofisticado pero también puede funcionar en un laboratorio con un baño María y una batería de moto”, dice Londoño confiada en que ahí está la clave para que hasta en los más pequeños municipios de Colombia se puedan llegar a realizar pruebas COVID.
Actualmente en Colombia el tiempo promedio entre la realización de una prueba y la entrega de resultados son hasta 5 días cuando lo ideal sería tenerlas en menos de 24 horas. Cinco días sin saber con certeza si una persona está o no infectada complica la tarea de seguimiento de casos y aislamiento.
“Es una posibilidad muy real. De hecho, ya hay varios kits comerciales. Se puede realizar en menos de una hora y no necesitas gente tan especializada como para las pruebas de PCR en tiempo real”, comenta Silvia Restrepo, vicerrectora de investigación de la U. de los Andes.
Además, un grupo de investigación de esta universidad a cargo de Camila González, especialista en ecología de enfermedades, está colaborando con un grupo canadiense para probar otra prueba LAMP en Colombia. “Ellos inventaron un aparato que es como un lector de placas que puede funcionar con una batería. Tenemos que apropiarnos de la tecnología para ir a regiones remotas y probar en condiciones extremas de infraestructura y ver si funcionan el protocolo y la herramienta”, cuenta. El dispositivo tiene la capacidad de procesar 386 muestras simultáneamente.
Si suena tan sencillo crear una prueba LAMP, ¿por qué, seis meses después, no tenemos una en Colombia? La falta de comunicación y colaboración entre grupos de investigación, la incapacidad por parte de los políticos para escuchar a los investigadores y brindar apoyo, la pobre conexión entre científicos y sector privado, entre otros factores, parecen haberse combinado esta vez para darle otra ventaja más al coronavirus.
Pooling, una ayuda extra
Otro truco para aumentar la capacidad de pruebas es el pooling. Se trata de jugar con el número de pruebas y las probabilidades para, con los mismos recursos, expandir su potencial.
En vez de realizar pruebas individuales las muestras tomadas a los pacientes primero se agrupan. Si al mezclarlas salen negativas significa que todas las de ese grupo eran negativas. Pero si el resultado es positivo, entonces se hacen subgrupos y se repite el proceso. También se puede una prueba a cada muestra de ese grupo positivo. El resultado es que se consumen menos reactivos y tiempo.
Esta es una de las estrategias en las que trabaja el Instituto Nacional de Salud. Pablo Arbeláez, profesor de la U. de los Andes, es uno de sus entusiastas. Con sus colaboradores trabajan además en un sistema de inteligencia artificial que permitiría hacer un poco más eficiente todo el proceso.
El método es más eficiente cuando hay bajos niveles de infección, en alrededor del 1% de la población, porque las pruebas grupales tienen más probabilidades de ser negativas.